Nous allons étudier la phylogénie du gène de la thiorédoxine pour les 10 organismes suivants :

1. Helicobacter Pylori (Accession Number : P66928)
2. Bacillus subtilis (Accession Number : P14949)
3. Homo sapiens (Accession Number : P10599)
4. Penicillium chrysogenum (Accession Number : P34723)
5. Listeria monocytogenes (Accession Number : P0A4L4)
6. Escherichia coli (Accession Number : P0AA26)
7. Gallus gallus (Accession Number : P08629)
8. Mus musculus (Accession Number : P10639)
9. Neurospora crassa (Accession Number : P42115)
10. Drosophila melanogaster (Accession Number : P47938)

Pour chacun de ces organismes est donné entre parenthèse le numéro d'accession permettant d'identifier la protéine codant pour la thiorédoxine.

Acquisition des données

	  P66928 P14949 P10599 P34723 P0A4L4 P0AA26 P08629 P10639 P42115 P47938
	

Pour faire une phylogénie, il faut commencer par trouver un critère de classification commun à toutes les espèces concernées. La thiorédoxine est une protéine que l'on trouve chez tous les organismes vivants, car elle intervient de dans de nombreux processus cellulaires. C'est donc un bon point de départ.

Préparation des données

Pour pouvoir comparer ces séquences afin de construire une phylogénie, nous devons construire un alignement multiple.

Avant de construire une phylogénie, il faut s'assurer de la correction de l'alignement multiple. Pour cela, il est possible de tirer parti de connaissances extérieures sur la fonction des séquences étudiées, en vérifiant par exemple que les domaines connus soient bien alignés. Pour un ensemble de protéines ayant la même fonction, on doit retrouver un même domaine dans leurs séquences protéiques. Celui-ci doit être visible au niveau de l'alignement.

Pour identifier les domaines des protéines liées à la thiérodoxine, nous allons interroger la banque de données InterPro.

Le bon alignement du domaine sur toutes les séquences nous donne une indication sur la pertinence de notre alignement : notre alignement est au moins correct au niveau de ces domaines.

Une petite remarque : en général, il est également souhaitable de "nettoyer" l'alignement multiple, en supprimant les régions non informatives, celles qui sont mal conservées. Sur cet exemple, comme les séquences sont relativement bien conservées, cela n'est pas nécessaire.

Matrice de distances

Il existe plusieurs techniques pour reconstruire un arbre phylogénétique à partir de données moléculaires. En cours, vous avez vu ou vous verrez les méthodes de parcimonie et les méthodes de distance (comme UPGMA). Pour ce TP, vous allez appliquer une méthode de distance, appelée Neighbor Joining. Neighbor Joining est conçue dans le même esprit que UPGMA. Elle regroupe les séquences deux par deux progressivement à partir de la matrice de distances. Mais, contrairement à UPGMA l'hypothèse d'une distance ultramétrique n'est plus faite, ce qui évite de nombreuses erreurs.

Nous allons transformer cet alignement en matrice de distance. A partir de l'alignement obtenu sur ClustalW, nous calculons pour chaque couple d'espèces leur distance évolutive. Le fonctionnement est similaire au calcul du score de l'alignement.

Vous devrez obtenir une matrice de distances

Construction de l'arbre

Avec la matrice de distance, nous allons calculer un arbre phylogénétique non enraciné en utilisant la méthode de Neighbor Joining.

L'arbre se trouve sous la forme d'une expression parenthésée :

que l'on peut trouver plus lisible sous la forme suivante :

Attention : cet arbre est non enraciné ! Notez que les valeurs (après ':') indiquent ici la taille de chacune des branches.

Visualisation de l'arbre et de sa pertinence

Il est possible d'afficher un arbre sous forme graphique (plutôt que parenthésé). Nous allons pour cela lancer Drawtree sur l'arbre parenthésé précédent.

Evaluation de la robustesse de l'arbre

L'arbre que vous venez d'obtenir semble globalement réaliste. Mais il se peut que localement, ou concernant les longueurs des branches, celui-ci ne soit pas correct (la longueur des branches est indicative de l'évolution). Il est possible de tester la robustesse d'un arbre phylogénétique avec des techniques de bootstrap. L'idée du bootstrap est que si l'on effectue des petits changements sur les données on doit être capable de retrouver le même arbre. Concrètement, à partir de l'alignement multiple initial obtenu avec ClustalW, on construit des nouveaux alignements qui sont obtenus en échangeant des colonnes. C'est légitime car les méthodes de reconstruction phylogénétique supposent que les sites évoluent de manière indépendante. Pour chaque nouvel alignement, on construit une matrice des distance, puis l'arbre correspondant.

A partir des 50 arbres du bootstrap, il faut en obtenir un seul. En faisant un consensus strict, on fait l'union des 50 arbres, ce qui permet de mettre en évidence les noeuds mal résolus dans les arbres.

L'utilisation du consensus peut aussi se faire d'une autre manière en affectant à chaque noeud des valeurs de bootstrap. A chaque noeud, on indique le degré de confiance, en comptant le nombre d'arbres pour lesquels les deux groupes issus du noeud sont séparés. C'est ce qu'on appelle le consensus majoritaire. Revenez au calcul du consensus et choisissez cette fois l'option consensus majoritaire.

De l'origine des cichlidés

Cet exemple est du à Xavier Vekemans, d'après l'article "Similar morphologies of cichlid fish in Lakes Tanganyika and Malawi are due to convergence." [PMID: 8025722].

Nous nous intéressons à l'évolution des Cichlidés, une famille de poissons d'eau douce. Nous nous intéressons à leur évolution dans deux grands lacs Africains : le lac Malawi (A) et le lac Tanganyika (B).

Parmi les espèces de ces deux lacs, nous porterons notre intérêt sur 12 d'entre elles : Petrochromis sp, Bathybates ferox, lobochilotes labiatus, Tropheus brichardi, Cyphotilapia frontosa et Julidochromis ornatus pour le lac Tanganyika ; Petrotilapia sp., Rhamphochromis sp., Placidochromis milomo, Pseudotropheus microstoma, Cyrtocara moori et Melanochromis auratus pour le lac Malawi.

Ces 12 espèces (6 par lacs) se ressemblent deux à deux d'un point de vue morphologique. Pour une espèce du lac Tanganyika (T) on peut lui associer une espèce du lac Malawi (M). Voici les correspondances :

On peut éventuellement expliquer ces similitudes par deux types d'évolution

Homoplasie (convergence des caractères) :

Il y a eu évolution indépendante des poissons dans les deux lacs. les caractères similaires sont dus au milieu similaire ainsi qu'aux mêmes pressions évolutives.

Un des deux lacs (T) est plus ancien que l'autre, on peut supposer qu'il y a d'abord eu une migration de T vers M puis évolution indépendante dans les deux lacs.

Homologie :

On considère ici que toutes les ressemblances sont dues à l'existence d'un ancêtre commun pour chacune des 6 espèces possédant les mêmes caratères que les 2 espèces respectives des deux lacs.

Il y a donc eu plusieurs évenements de migration de T vers M (un pour chaque espèce).

Le choix de l'hypothèse

Votre but est de déterminer quelle hypothèse est la plus vraissemblance en vous basant sur une analyse phylogénétique. Pour éviter de baser votre phylogénie sur des caractères adaptatifs (morphologiques) vous allez utiliser des séquences non codantes et donc non soumise à la pression évolutive.

Voici les 12 séquences : all.fas.

Aide

Logiciels

Vous pouvez vous aider des logiciels disponibles sur Mobyle, en particulier :

1. Alignement : ClustalW.
2. Calcul des distances :DNAdist calcule une matrice de distances à partir de l'alignement multiple de ClustalW.
3. Calcul de l'arbre non enraciné à l'aide d'une méthode UPGMA ou Neighboor Joining : à partir de la matrice de distances, vous pouvez utiliser Neighbor qui implémente les deux algorithmes.
4. Calcul de l'arbre non enraciné avec la parcimonie ou le maximum de vraisemblance : DNAPars et DNAML construisent cet arbre en utilisant directement l'alignement multiple de ClustalW.
5. Générer des boostraps : chacun des logiciels précédents donne accès à un paramètre de bootstrap. Vous utiliserez le Consensus strict ou majoritaire quant cela sera nécéssaire (Consense).
6. Dessiner les arbres : vous utiliserez les logiciel DrawTree (arbre non enraciné), et DrawGram (arbre enraciné).

L'enracinement de l'arbre

On vous propose deux jeux de séquences de la famille des Cichlidés, l'un provenant de l'espèce Geophagus brasiliensis d'Amérique du Sud (newworld.fas), l'autre de l'espèce Cyprichromis Leptosoma de l'île de Malasa située dans le lac Tanganyika. (malasaisland.fas).

L'évolution des Cichlidés