L'étude de protéines.

Nous allons étudier en parallèle plusieurs protéines à l'aide d'outils bioinformatiques. Le site NPSA du Pole BioInformatique Lyonnais et les Proteomic tools d'ExPASy regroupent de nombreux logiciels d'étude des protéines. Nous n'allons pas tous les utiliser au cours de ce TP.

I. Identification de protéines.

1. A partir d'un gel 2D.

Les informations données par un gel 2D à propos d'une protéine sont le point isoélectrique et la masse moléculaire. Ces informations ne sont pas toujours suffisantes pour identifier formellement une protéine, surtout si les séquences des protéines de l'organisme étudié ne sont pas toutes connues.

Le programme TagIdent recherche toutes les protéines d'une banque de données qui ont un pI et un PM compris dans un intervalle donné. Les valeurs de pI et PM pour les protéines de la banque sont calculées (non expérimentales). Il est éventuellement possible de préciser un court peptide appartenant à la protéine recherchée. Le peptide est recherché de façon exacte dans les protéines qui répondent aux critères de pI et PM.

• Recherchez une protéine de Escherichia coli dont le PI observé sur un gel est de 5,01 (précision 0,25) et la masse moléculaire est de 51702 Da (précision de 10%). N'oubliez pas de préciser que la recherche se fait uniquement sur les entrées de Escherichia coli, à l'aide du champ "OS or OC".
• Combien d'entrées sont trouvées ?
• Est-ce qu'il est possible d'identifier la protéine observée sur le gel ?

Pour affiner la recherche, il est nécessaire de séquencer un fragment de la protéine. Voici le fragment obtenu : HYVEK. Il faut cocher l'option "Tagging" et indiquer le peptide dans la zone de saisie qui suit la phrase "Tag (up to 6 amino acids):" pour que la recherche du peptide soit effective.

• Est-ce que, cette fois-ci, la protéine peut-être identifiée ?
• Quelle est la protéine trouvée ? Par la suite, j'appelerai cette protéine AceA.
• Mémoriser la séquence de cette protéine au format FASTA dans un fichier.

2. A partir d'un peptide.

Une protéine d'Erwinia chrysanthemi a été isolée et un fragment a été séquencé : VILVFF.

• Faites un Blastp de ce peptide contre UniProt à l'aide de l'interface d'Expasy. Limitez la recherche aux séquences de bactéries. Attention, nous sommes dans le cas d'une recherche de peptide, il faut donc adapter le seuil de E-value.
• Est-ce que les protéines trouvées possèdent, dans l'ensemble, la même fonction ou est-ce que les fonctions trouvées sont très disparates (vous noterez que le transport peut être effectué au travers de la membrane). ?
• Quelle est la fonction majoritaire ? C'est surement la fonction de notre protéine. J'appelerai par la suite cette protéine, PutP.

Pour travailler ensuite sur une séquence protéique, nous allons mémoriser la séquence de l'organisme le plus proche d'E. chrysanthemi à savoir Yersinia pestis.

• Trouvez l'entrée correspondant à cet organisme et ayant la fonction supposée de notre protéine dans la liste des résultats de BlastP.

II. Etude complète de protéines.

Nous avons trois protéines de Erwinia chrysanthemi obtenues à partir de fragments de la séquence génomique. Voici les séquences de ces protéines telles qu'elles sont données dans l'annotation du génome :

>clone53
MKKIAIISSFSESCGNAYFTRILMDSMTDAGVQVECLSLNLLLTQSVNPEVRKKADKHIDDLCEKLKQFDGVNIQFEAGL
YGTIPSDIIKRTLKLVSANPHTSVTLHSPRLVSDSASQREAIKQALKLRIKTAIRMYFAELRRNVSTRLNATIIKNLIKR
RINIIAHTLRAKEQIELFFNYDNVHVHPLKIVDESHETSPDLLKAIRVKYKFRENDKIIGMFGFVNEYKGHSMAIKTLSC
MPKGYKLMIFGRQHPQTIKNNELVNHYISSLQHQIHCDKVADRVFFMGEYDNEDFINLAGSVDYVWLPYVENGQDGSGIA
SICMDVSKQVLCSSSFAFDELFRLIPDYSNYSRFDIGNYLELATKTTRFIPAKPKQASSGEKKYTLRSQAELYIKLSTE
>clone47
MALYGKKTDLSSASSGGYTGVADVYQLWNYHARGNGNIGDKPSYTLEQARDQITRGNITWNGEKVFGKSAALTYSFLQSV
ADSDMPDNFKGFVKFNAAQIQQTKLALQSWADVANVTFSEAKDGERATIQFGNYTLTPDGNTDNNSQAFGFYPGNWKWAG
SAWFNYNQADNQRPDINEFGRNTLTHEIGHTLGLYHPGDYDASDGNPGYKDVTYAEDTRQFSIMSYWNEGYTGGDFHGYH
AAAPLMDDIAAIQKLYGANMSTRTGDTVYGFHSNSGRDFYTATDSKTPLIFSVWDAGGNDTFDFSGYSANQRISLISGTF
SDVGGLKGNVSIAAGAVMENAIGGSGHDVIVGNLSDNRIDGGAGNDVLYGDGGADILTGGAGKDIFVYAWEKDSLSSAPD
TITDFQRGEDRIDLSAFNKNHDLRFVDNFSGKGNEVVLNWDSQSHQTNMWLHLSGHETADFLVNIVGAALQPSDVIV
>bino10
MNVWTVKKKLAMMIAAIIISFMVLVVFLLSRQTAITSELQRLYEKDYQAASIIGQIDGLLTRVDINILRMIAIGDPASIA
GWKSQNTENFTKVEGLLSKLKTIIDPTMAQSFDGLSSSYTLMRKGMEHQVQAVESGDIKNASEINKNEVKGPADKTFGEL
SALKKAQDDLANKKVVAQQSSDVTARIISLLAAAIVALGSVVLGAVILRGLLRQLGGEPVIAAQVVSQMAQGDLSSPIPV
KDHDHVSLLAQLQEMQSSLSGIVTSVRSNAESLATASIQISQGNQDLSQRTEEQASALQQTSATMEQLGSTVSNNAENAR
QANQLALGASTLAAEGGNMVERVIETMKGINDSSKKISDIINVIDSIAFQTNILALNAAVEAARAGEQGRGFAVVASEVR
SLAQRSANAAKEISTLITNSVGQVEQGSQLVDETGATMTQIVAAINQVTDIVSEISASSLEQSSGVKQVGQAITQIDTVT
QQNAALVEESAAAAENLKEQAQQLVQAVAVFQVTSNAAQPRLFLGR

Nous allons travailler sur les 5 protéines en parallèle (AceA, PutP, clone53, clone47 et bino10).

1. Prédiction de la fonction.

La comparaison d'une séquence protéique aux séquences connues ne donne pas toujours de résultats satisfaisants. Les protéines portant la même fonction ne se ressemblent pas toujours sur toute leur longueur. C'est pourquoi des banques spécialisées ont été développées. Elles contiennent des portions de séquences (motifs, domaines) connues pour être impliquées dans une fonction particulière. Il peut s'agir de sites actifs, de sites de fixation à un ligand, ...

La banque InterPro regroupe les principales banques de motifs, domaines et familles protéiques. Une entrée d'Interpro contient une description biologique de l'objet, ainsi que sa représentation dans les différentes banques.

Voici les résultats obtenus en soumettant les cinq séquences à InterPro.

Pour la protéine AceA, 2 familles sont trouvées. Consultez les deux entrées InterPro (lien IPRXXXXXX). Dans les entrées apparaît la ligne "Signatures". Il s'agit des différentes banques qui décrivent la famille (le domaine).

• Combien de banques sont indiquées dans chaque entrée ?
• La représentation graphique des résultats pour AceA indique les banques qui ont réellement trouvé un motif (domaine) sur cette séquence.
• Pour chaque entrée InterPro, combien de banques ont réellement trouvé un motif sur AceA ?
• Y as t'il pour une des entrées des banques qui ne trouvent pas le motif sur AceA? sur clone47 ?

Vous pouvez consulter l'entrée d'une banque qui trouve un motif à l'aide du lien qui se trouve juste devant le schéma. Pour les entrées PSXXXXX (ProSite) on dispose d'informations sur la pertinance des motifs

• Recherchez dans la description du motif le nombre de faux positifs connus, c'est-à-dire le nombre de séquences dans lesquelles un motif est trouvé alors que la séquence n'a pas la fonction biologique correspondante. Faites de même pour le nombre de faux négatifs, c'est-à-dire le nombre de séquences dans lesquelles le motif n'est pas trouvé alors que la séquence a la fonction biologique.
• Est-ce que le nombre de faux positifs ou faux négatifs indiqué est élevé ?
• Est-ce qu'il s'agit d'un vrai positif, faux positif ou faux négatif dans notre cas ?

Intéressez vous maintenant au motif PS00142 du clone47

• Recherchez dans la description du motif le nombre de faux positifs connus, c'est-à-dire le nombre de séquences dans lesquelles un motif est trouvé alors que la séquence n'a pas la fonction biologique correspondante.
• Est-ce que le nombre de faux positifs indiqué est élevé ?
• Est-ce qu'il s'agit d'un faux positif dans notre cas ?

Note : la cohérence entre les fonctions trouvées pour une même protéine peu également donner des indications sur la qualité des prédictions.

• Qu'est-ce que InterPro nous apprend sur la fonction des protéines ?
• Pour chaque protéine, notez sa ou ses fonctions enzymatiques si elles sont connues (n°EC) ou des mots-clés qui caractérisent leur fonction.

2. Etude des structures 2D et 3D.

Le site NPSA propose une interface qui fait tourner en même temps plusieurs logiciels de prédiction de structure 2D. L'affichage des résultats contient une ligne par logiciel de prédiction plus une ligne qui est la séquence consensus des résultats obtenus par l'ensemble des logiciels. L'adresse du site est : http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html.

Les conventions de représentation des structures 2D de base les plus répendues sont :

• h : helix = hélice alpha
• e : extended strand = feuillets béta
• c : coil = boucle

Etudiez la structure 2D de la protéine aceA uniquement.

• Quelle est la structure 2D de base (hélice, feuillet, ...) majoritaire pour cette protéine ?

Je ne vais pas vous faire utiliser de logiciels de prédiction de structure 3D car ils prennent beaucoup de temps et ne sont pas toujours très fiables. De plus, la structure de protéines de la même famille que celles que l'on étudie a été déterminée expérimentalement. Nous allons rechercher ces structures dans les banques.

Seule la structure 3D de AceA a été déterminée expérimentalement. Cette structure a pour identifiant 1IGW dans la banque de structures 3D PDB.

• Visualisez une représentation de la molécule à partir de la partie "Images and Visualization" présent dans l'entrée 1IGW.

3. Prédiction de la localisation cellulaire.

Plusieurs sources d'information peuvent être croisées pour estimer la localisation cellulaire d'une protéine. Par exemple, on peut estimer si la protéine est membranaire ou non en utilisant un logiciel de prédiction de domaines transmembranaires. Il existe également des logiciels de prédiction de peptides signaux.

1. Pour la prédiction de domaines transmembranaires, je vous conseille d'utiliser le logiciel TopPred dont le lien est présent dans la page des Proteomics Tools.

• Est-ce que qu'une des cinq protéines contient des domaines transmembranaires ?
• Si oui, quelle est la position de ces régions transmembrabranaires potentiels?
• Est-ce que ces prédictions sont cohérentes avec nos connaissances sur la fonction des protéines ?

2. Pour la prédiction de peptide signal, vous pouvez utiliser SignalP qui fait des prédiction pour différents organismes. N'oubliez pas que E. chrysanthemi, E. coli et Y. pestis sont des bactéries Gramm-.
Ce site limite le nombre d'interrogations d'un même domaine Internet (Etablissement) effectuées dans une journée. Je vous donne les résultats pour ceux qui n'ont pas pu accéder au site.

• Est-ce qu'une des séquences contient un peptide signal ?

4. Etude de réseaux cellulaires.

La banque KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) a pour ambition de représenter les interactions moléculaires qui se déroulent au sein des cellules, de la façon la plus générale possible.

Au contraire, Ecocyc propose des schémas propres à un organisme donné, E. coli. Etant donné que beaucoup d'informations sont connues sur cet organisme, la banque est très documentée : descripton précise des protéines, du gène correspondant (information sur les opérons), des voies métaboliques, de la régulation des gènes, ... Maintenant, cette banque a été étendue à d'autres organismes.

• Recherchez dans Ecocyc les fonctions protéiques trouvées pour les cinq protéines (même si elles ne proviennent pas de E. coli).
• Quelles sont les informations que vous obtenez sur les protéines, leurs gènes, leurs voies métaboliques (pathway), leurs régulations, ... ?

Dans KEGG, cliquez sur le lien "KEGG2 - table of content", puis sur le lien "Pathway" de la colonne "DBGET search" du premier tableau. Tapez alors les mots-clés dans la zone de saisie pour essayer de trouver les protéines non vues dans EcoCyc.

• Est-ce que l'on trouve toutes les fonctions manquantes ?
• Quelles sont les informations données par KEGG ?

Vous pouvez aller faire un petit tour du côté de biocarta pour étudiez les pathways des eucaryotes.

De même vous pouvez aller interroger les GO terms (Gene Ontology) avec AmiGO

III. Comparaison 1D, 2D et 3D de protéines.

Nous allons étudier trois protéines de la même famille (les globines) pour rechercher à quel niveau se situe leurs ressemblances et différences. Le but de cet exercice est de constater que des protéines différentes au niveau de leur séquence peuvent se ressembler au niveau de leur fonction et de leur structure.

Voici les séquences des 3 protéines que nous allons étudier :

>Globin I (Dimeric hemoglobin)
PSVYDAAAQLTADVKKDLRDSWKVIGSDKKGNGVALMTTLFADNQETIGYFKRLGDVSQG
MANDKLRGHSITLMYALQNFIDQLDNPDDLVCVVEKFAVNHITRKISAAEFGKINGPIKK
VLASKNFGDKYANAWAKLVAVVQAAL
>Leghemoglobin II
GALTESQAALVKSSWEEFNANIPKHTHRFFILVLEIAPAAKDLFSFLKGTSEVPQNNPEL
QAHAGKVFKLVYEAAIQLQVTGVVVTDATLKNLGSVHVSKGVADAHFPVVKEAILKTIKE
VVGAKWSEELNSAWTIAYDELAIVIKKEMNDAA
>Myoglobin
VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASED
LKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRHP
GDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG

1. Etude et comparaison des structures 1D (séquences).

J'ai fait tourner pour vous le logiciel PRSS qui évalue la significativité d'un alignement de deux séquences. Voici les résultats obtenus pour les 3 paires possibles :

• alignement globin avec leghemoglobin
• alignement globin avec myoglobin
• alignement leghemoglobin avec myoglobin

• Que dire sur la significativité des scores ?
• Est-ce que ces séquences semblent être de la même famille ?

Par alignement, le fait que ces protéines soient de la même famille n'est pas flagrant. Particulièrement, la léghemoglobine ne ressemble pas aux deux autres. La banque InterPro permet d'identifier des domaines protéiques, mais peut aussi indiquer à quelle famille appartient une protéine. Ces prédictions sont uniquement basées sur la séquence primaire des protéines.

• Soumetez les 3 séquences à InterPro.
• Est-ce que les 3 protéines font partie de la même famille fonctionnelle et de la même famille structurelle (SSF est une banque de famille structurelle) selon InterPro ?

2. Etude et comparaison de la structure 2D.

Utilisez le programme du site NPSA pour prédire la structure 2D de chacune des 3 protéines.

• Quelles sont les structures 2D de base majoritaires sur chaque protéine ?

J'ai extrait des résultats de prédiction de structure 2D, le consensus obtenu pour chaque structure. Pour les colonnes non résolues (notées à l'aide d'un point d'interrogation), j'ai décidé arbitrairement de leur affectuer la lettre qui précède cette postion. Enfin, j'ai lancé Clustal sur ces séquences de structures en choisissant la matrice identité. Voici l'alignement que j'ai obtenu.

• Est-ce que les trois protéines se ressemblent au niveau de leur structure 2D ?

3. Visualisation de structure 3D.

Plusieurs logiciels gratuits sont disponibles pour visualiser des structures 3D de protéines décrites dans des formats particuliers. Il existe trois formats principaux en biologie :

• Brookhaven (PDB)
  • en-tête avec des informations générales sur les molécules modélisées (et éventuellement leur structure 2D)
  • coordonnées des atomes qui composent la structure (ATOM = atome de la protéine ; HETATM = HETeroAToM = atome des cofacteurs, substrats, ions, ... liés par une liaison covalente à la protéine)
  • d'autres molécules que des protéines (comme l'ADN) peuvent être modélisées
• mmCIF (macromolecular Crystallographic Information Format)
• ASN.1 : format développé par le NCBI, lu par le logiciel CN3D.

Nous allons travailler avec le logiciel Deep View. Il est peut-être installé sur vos machines. Sinon, il faut le faire en le téléchargeant à partir du site : http://www.expasy.org/spdbv/.

Voici une description rapide du logiciel. Il est découpé en plusieurs fenêtres :

• Fenêtre centrale : affichage de la ou des molécules en 3D (possibilité de rotation, déplacement et zoom sur la représentation) et accès à tous les menus.
• "Control Panel" : liste de tous les acides aminés ou autres molécules représentées sur le graphique. Le menu gris en-dessous de la barre de titre contient le nom de toutes les modélisations affichées dans la fenêtre principale. Il est possible de les faire apparaitre ou disparaitre de l'écran ("visible") et de les faire bouger individuellement ("can move"). Les informations sont représentées sous la forme d'un tableau dont les trois premières colonnes décrivent les molécules représentées et les suivantes permettent de modifier l'affichage (globalement ou pour une sélection) :
  • Colonne 1 : nom (A, B ...) de la chaine concernée, s'il y en a plusieurs ; sinon la colonne est vide. Un click sur ce nom sélectionne toute la chaine correspondante.
  • Colonne 2 : type de structure 2D de base (h pour hélice, e pour feuillet, ...), si elle est connue. Un click sur la lettre sélectionne toute la structure 2D de base correspondante.
  • Colonne 3 : nom de l'acide aminé ou autre type de molécule et sa position dans la chaine. Un click sur le nom sélectionne l'acide aminé correspondant.
  • Colonne 4 (show) : affiche les carbones alpha des acides aminés cochés.
  • Colonne 5 (side) : affiche les chaines latérales des acides aminés cochés.
  • Colonne 6 (label): affiche le nom des acides aminés cochés.
  • Colonne 7 (::V) : affiche les sphères de van der Waals autour des atomes dont les résidus sont cochés.
  • Colonne 8 (ribn) : représente la structure formée par les acides aminés cochés en représentation "fil de fer"
  • Colonne 9 (col) : change la couleur des acides aminés cochés. Le trait signifie que la couleur par défaut est utilisée.
  • Menu sous Colonne 9 (triangle noir) : précise la représentation concernée par la couleur affichée. Il est possible, par exemple, de changer la couleur des chaines carbonées ou des "ribbons".
  Un click sur le nom des colonnes d'affichage coche les acides aminés sélectionnés et modifie en conséquence l'affichage de la molécule. Un click avec le bouton droit dans une colonne décoche toute la colonne, un deuxième click recoche tout. Plusieurs sélections peuvent être assemblées à l'aide de la touche "ctrl".
• "Alignment" : affiche l'alignement des séquences protéiques. Des sélections peuvent être effectuées à partir de cet écran.
• "Layers infos" : affiche la liste de toutes les modélisations représentées dans la fenêtre principale avec certaines de leurs caractéristiques (visible ou non, ...). Certaines valeurs peuvent être modifiées directement à partir de cette fenêtre.

Je vous donne les structures 3D trouvées expérimentalement pour les 3 protéines :

• Globin I : 3SDH (2 chaines d'hémoglobine qui forment un homodimère)
• Leghemoglobin II 2 : 2GDM
• Myoglobin : 1MBD

Vous pouvez visualiser ces structures à l'aide du logiciel SPDBV, après les avoir enregistrées sur votre ordinateur.

4. Alignement de structures 3D.

Suivez les instructions suivantes pour effectuer un alignement structural des trois protéines, à l'aide du visualisateur Deep View :

• Ouvrez les trois structures 3D de protéines en même temps dans Deep View.
• Recentrez l'image pour que l'on visualise les 3 protéines en même temps (premier icone en dessous du menu file).
• Colorez en vert les chaines A et B de la globine (3SDH). Pour colorer une protéine, il faut d'abord la rendre active dans le "control panel" en la sélectionnant dans le menu déroulant situé sous le titre. Puis, il faut sélectionner tous ses acides aminés (click dans la première colonne) et cliquer sur "col", une boite de dialogue pour sélectionner une couleur s'ouvre.
• Colorer en rouge la myoglobine (1MBD).
• Colorer en bleu la léghemoglobine (2GDM).
• Aligner la globine à la myoglobine à l'aide du menu : Fit->Iterative Magic Fit.
• De la même façon, aligner la myoglobine à la léghémoglobine.
• Pour afficher l'alignement des séquences d'après leur structure, demander l'ouverture de la fenêtre d'alignement à l'aide du menu Window->Alignment. Puis, générer l'alignement à l'aide du menu Fit->Generate structural alignement. Les acides aminés qui sont proches d'un point de vue structurel sont sur fond gris dans l'alignement.

• Est-ce que les trois protéines ont des structures 3D proches ?
• Est-ce que cela confirme les observations précédentes ?

5. Conclusion.

Des protéines qui se ressemblent peu au niveau de leur séquence peuvent être de la même famille fonctionnelle et se ressembler beaucoup au niveau de leur structure 3D.